Η Εποχή του Λίθου χαρακτηρίζεται από τις μετακινήσεις πληθυσμών μεταξύ των ηπείρων, την εξέλιξη του ανθρώπινου είδους και τις αργές πολιτισμικές μεταβολές που επιταχύνθηκαν στο τελευταίο της στάδιο.
Χωρίζεται συμβατικά σε τρεις περιόδους, την Παλαιολιθική (1.000.000 πριν από σήμερα έως 10.000 χρόνια π.Χ.), τη Μεσολιθική (10.000-6800 π.Χ.) και τη Νεολιθική (6800-3200 π.Χ.).
Κατά μήκος του διαδρόμου που οδηγεί από το μυθικό παρελθόν στα υλικά κατάλοιπα της Εποχής του Λίθου, εκτίθενται ευρήματα που πιστοποιούν την αρχαιότερη παρουσία του ανθρώπου στη βοιωτική γη.
Πρόκειται για μια μακρά περίοδο χιλιάδων αιώνων, με λιγοστά ή δυσδιάκριτα υλικά υπολείμματα, τα οποία ανασύρθηκαν κυρίως από τα βάθη σκοτεινών σπηλαίων.
Η Παλαιολιθική περίοδος σημαδεύεται από έντονες κλιματικές εναλλαγές μεταξύ θερμών και παγετωδών περιόδων, κατά τις οποίες ο ελλαδικός χώρος είχε ηπιότερες συνθήκες που τον κατέστησαν καταφύγιο των πληθυσμών της βόρειας Ευρώπης. Στις εκτάσεις ξηράς που κάλυπταν και το Αιγαίο, οι παλαιολιθικοί άνθρωποι μετακινούνταν συνεχώς για κυνήγι, συλλογή άγριων καρπών και αλιεία. Διέμεναν σε υπαίθριους καταυλισμούς, σπήλαια και βραχοσκεπές, και κατασκεύαζαν εργαλεία από λίθο και οστό, ένδειξη επιδεξιότητας και διανοητικής ικανότητας.
Στη Μεσολιθική περίοδο, μετά την υποχώρηση των παγετώνων στο τέλος της Παλαιολιθικής, επικράτησαν ηπιότερες κλιματικές συνθήκες. Σημειώθηκαν μετακινήσεις πληθυσμών μέσω της ναυσιπλοΐας, καθώς και στροφή προς τους θαλάσσιους διατροφικούς πόρους (ψάρια και οστρακοειδή). Τα μεγάλα ζώα εξαφανίστηκαν και το κυνήγι προσανατολίστηκε στα μικρά άγρια ζώα και πτηνά. Στο τέλος της Μεσολιθικής συντελείται σταδιακά η μετάβαση από το τροφοσυλλεκτικό στάδιο στο παραγωγικό, με την καλλιέργεια δημητριακών και οσπρίων και την εξημέρωση ζώων.
Στη Νεολιθική περίοδο, η ανάπτυξη της γεωργίας και της κτηνοτροφίας ήταν συνυφασμένη με την εγκατάσταση σε μόνιμους οικισμούς και οδήγησε στην αύξηση του πληθυσμού. Παράλληλα συνεχίστηκε και η χρήση των σπηλαίων. Στη Βοιωτία υπαίθριοι νεολιθικοί οικισμοί έχουν εντοπιστεί κυρίως στα πεδινά μέρη, κατά μήκος των ποταμών και στα παράλια του Ευβοϊκού κόλπου, δηλαδή σε σημεία που συνδύαζαν καλλιεργήσιμες εκτάσεις, βοσκοτόπους, βουνά, ποτάμια και λίμνες, και έδιναν στους κατοίκους τη δυνατότητα να προσπορίζονται την τροφή τους τόσο από την καλλιέργεια της γης και την κτηνοτροφία, όσο και από το κυνήγι και την αλιεία. Καλύτερα ερευνημένοι είναι οι νεολιθικοί οικισμοί της Χαιρώνειας (Μαγούλα Μπαλωμένου), του Ορχομενού και της Εύτρησης.
Τα αντικείμενα των Προθηκών 21-27 δίνουν μια ολοκληρωμένη εικόνα της καθημερινής ζωής στην Εποχή του Λίθου. Εκτίθενται πήλινα και μαρμάρινα ειδώλια, καθώς και εργαλεία, όπως ξέστρα και λεπίδες από πυριτόλιθο, αξίνες, λεπίδες και πυρήνες οψιανού, λίθινα βαρίδια, αγκίστρια και υφαντικά εξαρτήματα. Ταυτόχρονα παρουσιάζονται όπλα (αιχμές βελών από οψιανό, λίθινα βλήματα σφενδόνης), κοσμήματα (περίαπτα, χάντρες,διακοσμητικά όστρεα, περιδέραιο) και χαρακτηριστική κεραμική της εποχής, πριν την ανακάλυψη του τροχού.