Κατά τη διάρκεια της ελληνιστικής περιόδου, η οποία σημαδεύεται αρχικά από τη μακεδονική κυριαρχία και στη συνέχεια από τη ρωμαϊκή, η Βοιωτία αποσύρεται σταδιακά από το προσκήνιο, συνεχίζοντας ωστόσο να αποτελεί θέατρο σημαντικών πολεμικών αντιπαραθέσεων.
Η μακεδονική κυριαρχία είχε σοβαρές συνέπειες στην πολιτική συγκρότηση του ελλαδικού χώρου, μετατοπίζοντας το κέντρο βάρους από την Ελλάδα στην Ανατολή και φέρνοντας στο προσκήνιο ευρείς πολιτικούς σχηματισμούς, με τη μορφή εκτεταμένων βασιλείων.
Οι παλαιές πόλεις–κράτη διατήρησαν τους πολιτειακούς θεσμούς τους αλλά έχασαν τη δυνατότητα αυτοπροσδιορισμού, καθώς οι μονάρχες των ελληνιστικών βασιλείων επενέβαιναν συνεχώς στα εσωτερικά τους ζητήματα. Διατηρήθηκαν είτε ως κέντρα πολιτισμού, όπως π.χ. η Αθήνα, είτε συνασπίστηκαν σε ομοσπονδίες (Αχαϊκή Συμπολιτεία, Κοινό των Αιτωλών), σε κάθε περίπτωση ωστόσο με μικρή δυνατότητα αυτονομίας.
Μετά τη μάχη της Χαιρώνειας, ο Φίλιππος Β΄ ανασύστησε το Κοινό των Βοιωτών με έδρα την Ογχηστό, δίχως τη συμμετοχή της Θήβας, η οποία προσχώρησε πολύ αργότερα (287 π.Χ.) και μετά την ανοικοδόμησή της. Κάθε πόλη εκπροσωπείτο από ένα μόνο βοιωτάρχη, ενώ αργότερα, ο επώνυμος άρχοντας αντικαταστάθηκε από τον στρατηγό, κατά το πρότυπο της Αχαϊκής Συμπολιτείας.
Στη Βοιωτία οι ισορροπίες ανατράπηκαν βίαια. Η αρχή των ελληνιστικών χρόνων βρίσκει τη Θήβα σωρό ερειπίων, ενώ ο Ορχομενός, οι Θεσπιές και οι Πλαταιές, πόλεις που η ίδια είχε καταστρέψει, επανοικίσθηκαν από τους Μακεδόνες και αναπτύχθηκαν εκ νέου.
Λίγο αργότερα (316 π.Χ.) ξεκινά η ανοικοδόμηση της Θήβας από τον Κάσσανδρο, βασιλέα της Μακεδονίας, στον έρανο του οποίου ανταποκρίνονται με θέρμη πόλεις και ιδιώτες. Όμως στο αναδιοργανωμένο Κοινό των Βοιωτών η Θήβα εισέρχεται μόνο κατά τη δεύτερη δεκαετία του επόμενου αιώνα. Οι βοιωτικές πόλεις συμμετείχαν κατ’ ανάγκη στους πολέμους μεταξύ των διαδόχων του Αλεξάνδρου Γ’, συντασσόμενες με όποιον εξυπηρετούσε τα συμφέροντά τους. Γενικά, η στάση τους ήταν φιλομακεδονική, αν και το 197 π.Χ. αναγκάσθηκαν να συμμαχήσουν με τους Ρωμαίους εναντίον τωνΜακεδόνων.
Αργότερα (171 π.Χ.) όσες πόλεις συμμάχησαν με τον Μακεδόνα βασιλέα Περσέα κατά των Ρωμαίων, υπέστησαν δεινή καταστροφή (Αλίαρτος,Κορώνεια, Θίσβη) και το Κοινό των Βοιωτών διαλύθηκε.
Η αστάθεια που επικράτησε είχε αρνητικές επιπτώσεις στην οικονομία. Ο πλούτος και κυρίως η γη συγκεντρώνεται σταδιακά στα χέρια των λίγων και έτσι δημιουργείται μία νέα κυρίαρχη κοινωνική τάξη στη Βοιωτία.
Η Ρώμη καταλύει αρχικά το βασίλειο της Μακεδονίας (168 π.Χ.) και στη συνέχεια κυριαρχεί και στη νότιο Ελλάδα (146 π.Χ.). Το 148 π.Χ. η συμμαχία των Βοιωτών με τους Αχαιούς προκαλεί την εισβολή του Ρωμαίου στρατηγού Μέτελλου και λίγο αργότερα του Μόμμιου (146 π.Χ.). Τότε επιβλήθηκαν στη Βοιωτία φιλορωμαϊκά καθεστώτα και βαριά φορολογία, με εξαίρεση κάποιες πόλεις, όπως οι Θεσπιές, που έχαιραν ειδικής μεταχείρισης επειδή είχαν σταθεί στο πλευρό των Ρωμαίων.
Τον 1ο αιώνα π.Χ. οι πόλεμοι του βασιλιά του Πόντου Μιθριδάτη εναντίον των Ρωμαίων και οι εμφύλιες συγκρούσεις των τελευταίων προξένησαν νέες καταστροφές στον ελλαδικό χώρο. Ο Σύλλας εισβάλλει στη Βοιωτία το 86 π.Χ. και αφαιρεί από τη Θήβα την μισή επικράτειά της. Η ειρήνη επήλθε με την επικράτηση του Οκταβιανού Αυγούστου στη ναυμαχία του Ακτίου το 31 π.Χ.
Παρά τις ασταθείς πολιτικές συνθήκες, η οικονομική και πολιτιστική διεύρυνση που επιτεύχθηκε προκάλεσαν την άνθηση της επιστήμης και των τεχνών.
Η πολυτέλεια ως κοινωνική αξία και η διεύρυνσή της στα μεσαία κοινωνικά στρώματα, επέβαλε την ανάπτυξη της μαζικής παραγωγής. Προϊόντα καθημερινής, λατρευτικής αλλάκαι ταφικής χρήσης παράγονται μαζικά και συχνά δίχως ιδιαίτερες καλλιτεχνικές αξιώσεις.
Ο επισκέπτης εισάγεται στην ενότητα 9 με ένα μαρμάρινο γυναικείο κεφάλι του 3ου αιώνα π.Χ. από τη Λιβαδειά (βάθρο 69). Η περιήγηση ξεκινά με την πολιτειακή οργάνωση, με εκθέματα όπως η στήλη με ονόματα των νέων Θεσπιέων, οι οποίοι ολοκλήρωσαν τη στρατιωτική τους θητεία κατά το έτος του άρχοντος του Κοινού των Βοιωτών Ισμηνία (βάθρο 71), το μολύβδινο σταθμίο από το ιερό του Ποσειδώνα στην Ογχηστό (Προθ. 152) και ο ετήσιος απολογισμός του ιππάρχου Πομπίδα (βάθρο 73).
Με οξυπύθμενους εμπορικούς αμφορείς από τη Χίο, την Κω και την Αττική στο βάθρο 74 και τις λιγοστές οικονομίες ενός παιδιού από τη Θήβα (Προθ. 153) παρουσιάζονται θέματα οικονομίας και εμπορίου.
Στη συνέχεια ο επισκέπτης κατευθύνεται στην ενότητα όπου αποτυπώνονται τα αποτελέσματα των πολεμικών συγκρούσεων και η ανασφάλεια της ελληνιστικής εποχής. Από το επίγραμμα του ταφικού μνημείου για τον Ακραιφνέα Εύγνωτο (βάθρο 76) μαθαίνουμε την τραγική ιστορία του, καθώς αυτοκτόνησε όταν συνειδητοποίησε την ήττα των συμπατριωτών του σε σύγκρουση με τους Μακεδόνες, κοντά στο ιερό του Ποσειδώνα στην Ογχηστό, πιθανόν το 292 π.Χ.
Ακολουθεί η μακέτα του τάφου μακεδονικού τύπου της Τανάγρας. Ιδιαίτερα σημαντική είναι η επιγραφή με κατάλογο των δωρεών για την ανοικοδόμηση της Θήβας, όπου μεταξύ των δωρητών αναφέρεται η Μεσσήνη, η Μεγαλόπολη, η Αθήνα, ηγεμόνες και πολίτες ακόμη και από την Κύπρο (βάθρο 78).
Στις Προθήκες 154-155 εκτίθενται «θησαυροί». Ξεχωρίζει αυτός από τη Θήβα, αποτελούμενος από 457 νομίσματα και χρυσά κοσμήματα, ο οποίος απεκρύβη ίσως κατά τη διάρκεια της εισβολής του Μετέλλου στη Βοιωτία το 146 π.Χ.
Η Προθήκη 156 περιέχει αντικείμενα καθημερινή ςχρήσης από οικίες και εργαστήρια της περιόδου, όπως αγγεία, γουδοχέρια, αγνύθες, κλαδευτήρια και πήλινη κυψέλη. Συμπληρωματική ψηφιακή διαδραστική εφαρμογή ξεναγεί τον επισκέπτη σε μία τυπική ελληνιστική οικία.
Στην Προθήκη 157 παρουσιάζονται αντικείμενα που σχετίζονται με τη μουσική και το χορό, ενώ στο βάθρο 80 εκτίθεται επιζωγραφισμένο ψηφιδωτό δάπεδο από τη Θήβα με παράσταση αυλητή, νικητή μουσικών αγώνων.
Το θέμα της δουλείας σχολιάζεται στο βάθρο 81, με την απελευθερωτική επιγραφή του 3ου αιώνα π.Χ. από τις Θεσπιές.
Ο επισκέπτης συνεχίζει τη γνωριμία με τον ελληνιστικό κόσμο με την Προθήκη 158 και τη χαρακτηριστική κεραμική της περιόδου. Ξεχωρίζουν κύλικα με την επιγραφή ΦΙΛΙΑC, τα αγγεία με διακόσμηση «δυτικής κλιτύος» και οι σκύφοι με ανάγλυφη διακόσμηση.
Η Προθήκη 159 είναι αφιερωμένη στη βοιωτική κοροπλαστική, η οποία γνωρίζει μεγάλη ανάπτυξη με τις «Ταναγραίες». Μαζί με την Προθήκη 160, η οποία περιέχει ειδώλια, αγγεία, κάτοπτρα και κοσμήματα, μας δίνουν μια εικόνα για την εμφάνιση και τις ασχολίες των ενηλίκων, εφήβων και παιδιών.
Στην επόμενη αίθουσα τα βάθρα 82-88 προσφέρουν σύντομη εικόνα της γλυπτικής των ελληνιστικών χρόνων.
Στην Προθήκη 161 φιλοξενούνται αντικείμενα που σχετίζονται με τα ταφικά έθιμα, ενώ στα βάθρα 89-91 παρουσιάζονται ταφικά αγγεία.
Από τα επιτύμβια μνημεία ξεχωρίζουν οι χαρακτηριστικοί βοιωτικοί πώρινοι θριγκοί, δηλαδή επιστέψεις που στερεώνονταν σε στενή στήλη και έφεραν συχνά το όνομα του νεκρού σηματοδοτώντας τον τάφο του (βάθρο 92), τα ατρακτόσχημα μυροδοχεία, ως δημοφιλή κτερίσματα, και η επιτύμβια στήλη του ποιητή Καπίωνα (βάθρο 93).